Биохимическое исследование активности ферментов

Наличие активных эндо- и экзогидролаз в слое слизистых наложений подтвердилось и результатами биохимического исследования активности ферментов, проведенного в опытах на предварительно оперированных здоровых ненаркотизированных собаках, у которых были вживлены фистулы в 12-перстную и тощую кишку.

Объектами исследования служили нативное тощаковое содержимое, вытекавшее из фистулы 12-перстной кишки, и биоптаты слизистой оболочки кишки, полученные путем цапочной биопсии.

Под бинокулярной лупой отделяли от биоптата слизистые наложения. Сохранность щеточной Каймы и гликокаликса после этой манипуляции контролировали с помощью электронной микроскопии. Массу наложений определяли, помещая их в предварительно взвешенный тигель с 0,5 мл раствора электролитов, изотоничного и изоионичного супернатанту тощакового содержимого 12-перстной кишки; pH этого раствора устанавливали равным pH, при котором определялась активность фермента.

Активностьα-амилазы определяли по методу 4 и выражали в условных единицах, определяемых по калибровочной кривой, которую строили, используя растворы кристаллического препарата амилазы (фирмы Serva) в концентрации от 0,5 до 0,05; в 1 мл раствора. Калибровочная кривая выводилась на основании 10 параллельных измерений с шагом 0,05 γ/мл; линейный участок шкалы от 0,195 — 0,475 γ/мл.

Исследуемые растворы исходно разводили таким образом, чтобы измеряемые величин находились в линейном участке калибровочной шкалы.

Активность трипсина в слизистых наложениях определяли по стандартной методике, а в дуоденальном содержимом — по той же методике, адаптированной для измерения на автоматизированном двухлучевом спектрофотометре фирмы «Karl Zeiss Jena» типа «Specord». В качестве субстрата использовался бен зоиларгининпаранитроанилид (БАПНА).

Активность химотрипсина в анализируемых образцах определяли, используя раствор сукцинилфенилаланинпаранитроанилида (СФАПНА); активность лейцинаминопептидазы — по модифицированному методу Тейлора, используя в качестве субстрата лейцинпаранитроанилид; активность катепсина В — по модифицированному методу Петтерса, используя субстрат бензоиларгениннафтиламид. Активность катепсина D — по модифицированному методу Баррета, используя в качестве субстрата 6%-ный раствор гемоглобина, предварительна очищенный на сефадексе, g = 25.

Активность исследуемых ферментов выражалась в микромолях образующихся продуктов гидролиза за 1 мин в расчете на 1 влажных наложений или 1 мл дуоденального сока.

«Пищеварение и гомеостаз»,
Ю.М.Гальперин, П.И.Лазарев

• Механизм транспорта веществ
• Получение липосом, используемых в экспериментах
• Строение молекулы гликопротеина слизи
• Транспорт веществ через слой слизи
• Получения информации о молекулярном строении гликопротеинов
• Обогащение слизистых наложений всеми фракциями липидов
• Полимерные питательные вещества и продукты их полостного гидролиза
• Определение лейцинаминопептидазы, катепсинов В и D, пепсина на поверхности двенадцатиперстной кишки
• Активность липолитических ферментов в тощаковом содержимом
• Присутствие ферментов в кишечной слизи
• Данные электронной микроскопии
• Объект морфологического исследования
• Наращивание слоя слизистых наложений со стороны поверхности стенки кишки