Активация клеточных протоонкогенов в трансформирующие онкогены путем точковых мутаций (Обработка рестрикционными эндонуклеазами ДНК — путь)
Протоонкоген и онкоген (а) расщепляли эндонуклеазами в одном и том же месте (б) и сегменты лигировали (в) перекрестно. Рекомбинанты испытывали на трансфекционную активность. «Вырезали» более мелкие фрагменты (г, д). В наименьших фрагментах (350 нуклеотидов) устанавливали последовательность оснований и выявляли точку мутации.
Специфические сегменты, «вырезанные», как указано выше, из двух генов, соединялись с помощью фермента ДНК-лигазы с образованием двух гибридных генов, одна часть которых происходила из онкогена, а другая — из протоонкогена. Гибридные молекулы испытывали в трансфекционном тесте в культуре мышиных фибробластов линии NIH ЗТЗ, чтобы определить, какая из них утратила онкогенную активность, а какая приобрела.
Именно таким способом удалось значительно сузить искомую критическую для неоплазии область после «скрещиваний» все более мелких сегментов онкогена и его клеточного гомолога — протоонкогена.
Для онкогена рака мочевого пузыря человека конечным фрагментом ДНК, обеспечивающим трансфекционный эффект, оказался блок из 350 нуклеотидов. При введении его в протоонкоген последний приобретал онкогенную активность. Соответственно аналогичный фрагмент протоонкогена, замещающий упомянутый выше нуклеотидный участок онкогена, лишал молекулу онкогена трансформирующей активности.
Это означало, что критический дефект, различающий два близкородственных гена, локализуется в сегменте, состоящем из 350 нуклеотидов. Анализ последовательности нуклеотидов активного и неактивного вариантов сегмента привел к неожиданному результату: активность или неактивность 350-нуклеотидной последовательности зависела от единственного нуклеотида — гуанин во фрагменте протоонкогена был заменен на тимин в онкогене.
Следовательно, замена единственного нуклеотида, т. е. точковая мутация, в 5000-нуклеотидном нормальном человеческом гене превращала его в онкоген.
Описанная работа была проделана в лаборатории R. Weinberg на клеточной линии EJ карциномы мочевого пузыря человека [Tabin С. et al., 1982]. Именно таким способом впервые был установлен конкретный генетический дефект, ведущий к бесконтрольному росту человеческой опухоли. Причиной точковой мутации мог быть любой фактор окружающей среды.
«Молекулярная онкология»,
И.Ф. Сейц, П.Г. Князев
Смотрите также:
- Схема В. М. Дильмана
- Непервичная роль ТФР в онкогенезе
- Метаболические особенности неоплазм
- Субфракция среднего Т-антигена
- РФ функционирующие в малигнизированной клетке
- Группы РФ
- Понимание функции и биологии РФ
- Киназные активности рецепторов различных РФ
- Пострецепторные пути митогенов
- Интересные аспекты неопластической трансформации
- Заключение
- Заключение (Функция клеточных онкогенов в канцерогенезе)
- Заключение (Новейшие данные)
- Трансформирующие факторы роста (ТФР)
- Изучение фосфорилирования тирозина
- Добавление инсулина к целым клеткам или солюбилизированным мембранам
- Ростовой фактор тромбоцитов (РФТ, PDGF)
