Кальций-фосфатную технику

Большинство исследователей с целью введения в клетку чужеродных образцов ДНК в настоящее время используют кальций-фосфатную технику, разработанную F. Graham, E. Van Der Eb (1973). Стерильные кальциевые преципитаты ДНК более эффективно захватываются реципиентными клетками. Дальнейшая судьба чужеродной ДНК, ее транспорт и проникновение в ядро изучены слабо.

Известно, что примерно 2 % введенной ДНК определенное время персистирует в трансфецированных клетках; этого, очевидно, оказывается достаточно для процесса интеграции экзогенной ДНК с геномом реципиентных клеток [Hill M., Huppert J., 1970]. Использование кальций-фосфатной техники введения препаратов ДНК в клетку существенно повысило эффективность процедуры трансфекции. Было показано, что эффективность трансфекции возрастает с улучшением принципов селекции трансформантов.

Значительное влияние на результаты трансфекции как метода обнаружения трансформирующих генов оказывают сами реципиентные клетки. В большинстве экспериментов для определения трансформирующих генов в ДНК опухолей человека в качестве реципиентных клеток использовали линию пренеопластических клеток мышей NIH ЗТЗ.

Эти клетки анэуплоидны, постоянно пролиферируют и, в отличие от нормальных диплоидных фибробластов, имеющих ограниченные сроки культивирования и количество пассажей, обладают строго выраженной зависимостью пролиферации от субстрата роста (подложки) и характеризуются контактным торможением роста.

Более того, у этих клеток обнаружена исключительно высокая чувствительность к восприятию в собственный геном и фиксации чужеродной ДНК- Появление фокусов трансформированных клеток в монослое, а также субстратнезависимую пролиферацию клеток NIH ЗТЗ в полужидком агаре стали использовать в качестве критерия успешной трансфекции. Тем не менее по непонятным причинам только 10—20 % испытуемых образцов ДНК из опухолей и опухолевых клеточных линий оказываются способными индуцировать трансформацию клеток NIH ЗТЗ в экспериментах по трансфекции [Pulciani S. et al., 1982; Land H. et al., 1983].


«Молекулярная онкология»,
И.Ф. Сейц, П.Г. Князев



Смотрите также: