Главная / Молекулярная онкология / Клеточные онкогены / Замена в плазмиде Т24-СЗ-фрагмента ДНК

Замена в плазмиде Т24-СЗ-фрагмента ДНК

Замена в плазмиде Т24-СЗ-фрагмента ДНК, локализованного между сайтами расщепления Xho I и Крп I, нормальными последовательностями полностью лишала его трансформирующей активности. Напротив, замена нормальной Xho I-Kpn I-области ДНК в pbc-N I (плазмида, содержащая фрагменты клеточного протоонкогена) соответствующим доменом плазмиды рТ24-СЗ, генерировала плазмиду (рХКТ-82), которая трансформировала клетки NIH ЗТЗ.

С помощью этой же генно-инженерной техники обмена рестрикционными фрагментами генов Т24 и c-has/bas авторы еще точнее локализовали место, ответственное за активацию Т24. Оно было локализовано в 0,9 т. п: о. Sac I-Kpn-рестриктазном фрагменте ДНК рТ24-СЗ и pbc-N I.

Найдено лишь одно изменение нуклеотидов, локализованное в позиции 655 от места расщепления эндонуклеазой Sac I. Гуанин нормального гена с-has/bas-l уступил место тимину в онкогене Т24. Е. Reddy и соавт. пришли к такому же заключению, как и С. Tabin и соавт., при изучении EJ-онкогена: активация клеточного с-has/bas-l, нормального протоонкогена, в клетках Т24 человеческой карциномы мочевого пузыря вызвана единственной точковой мутацией.

Было показано также, что мутировавший гуаниновый остаток является частью гексануклеотида ГЦЦГГЦ, который специфически распознается эндонуклеазой Nae I. Установлено, что Nae I расщепляет 6,4 т. о. ВагпН I-инсерт плазмиды pbc-N 1 в пяти местах, приводя к образованию 4 внутренних фрагментов ДНК: 0,2; 0,4; 0,6 и 0,9 т. о., тогда как переваривание этой эндонуклеазой плазмиды рТ24-СЗ (содержащей онкоген) дает лишь 3 внутренних фрагмента: 0,2; 0,6 и 1,3 т. о. Утрата Nae I-сайта расщепления внутри 1,3 т. о.-фрагмента подтверждает местоположение точки мутации.

Согласно проделанному ранее гетеродуплексному и рестрик-ционному анализам, первый экзон онкогена Т24 содержит кодирующую информацию для 37 аминокислот, находящихся между позициями 621 и 731.

Указанные наблюдения локализовали мутировавший гуаниновый остаток во втором основании триплета (655-й нуклеотид), кодирующего глицин— 12-й аминокислотный остаток нормального человеческого белка р21. Замещение гуанина протоонкогена на тимин в онкогене Т24 приводило к замене глицина нормального белка на валин онкобелка. Этого оказывалось достаточно для придания трансформирующих свойств генному продукту онкогена Т24 человека.


«Молекулярная онкология»,
И.Ф. Сейц, П.Г. Князев



Смотрите также: